Thèses

14 décembre 2004 à 14h, Salle de conférence de l'IBPC
David STROEBEL, UMR 7099, Physico-chimie moléculaire des membranes biologique

"Détermination de la structure du complexe cytochrome b6f par radiocristallographie"

9 décembre 2004 à 14h, Salle de conférence de l'IBPC
Aude CUNI, UPR 1261, Physiologie membranaire et moléculaire du chloroplaste

"Effets électrostatiques sur les potentiels rédox des cofacteurs et leurs conséquences sur les transferts d'électron dans les centres réactionnels photosynthétiques. Exemples dans les centres réactionnels des bactéries pourpres et dans le photosystème II"

Résumé :
Les potentiels rédox des cofacteurs font partie des paramètres fondamentaux contrôlant les transferts d'électron intraprotéiques. La valeur de ces potentiels est fortement influencée par l'environnement protéique, et notamment par les interactions électrostatiques entre cofacteurs. L'importance de ces interactions a été mise en évidence à travers l'étude de deux situations dans les centres réactionnels photosynthétiques :
1- Chez les bactéries pourpres, l'existence d'une interaction électrostatique entre P et c559 a été démontrée. Elle a été estimée à 50 mV d'une part expérimentalement par titration électrochimique, d'autre part par des calculs d'électrostatique continue. L'influence du champ électrique transmembranaire a également été étudiée.
2- Dans le photosystème II, la recombinaison de charges a été caractérisée chez des mutants dans lesquels le potentiel de la phéophytine est modifié, conduisant d'une part à une révision du potentiel de P, d'autre part à une nouvelle modélisation de la thermoluminescence.

30 Septembre 2004 à 10h, Salle de conférence de l'IBPC
Manuela ZOONENS, UMR 7099, Physico-chimie moléculaire des membranes biologiques

"Caractérisation des complexes formés entre le domaine transmembranaire de la protéine OmpA et des polymères amphiphiles, les amphipols. Application à l'étude structurale des protéines membranaires par RMN à haute résolution"

Résumé :
Les protéines membranaires sont habituellement maintenues solubles, en milieu aqueux, à l'aide de détergent. Or, le caractère dissociant de ces derniers, combiné à la nécessité de les employer en large excès, entraîne souvent une inactivation de la protéine étudiée. Depuis plusieurs années, nous développons au laboratoire de nouvelles familles de ten sio actifs, dont les amphipols. Ces polymères amphiphiles s’associent aux protéines membranaires par un attachement multipoint non covalent. Les complexes formés sont solubles en l’absence de détergent, et les protéines ainsi complexées sont généralement plus stables qu'en solution détergente. Parmi les nombreux domaines d’application des amphipols, l’un des plus intéressants concerne l'étude structurale des protéines membranaires par spectroscopie RMN des solutions. Pour développer cette application, nous avons choisi comme modèle une protéine de structure connue, le domaine transmembranaire de OmpA, une protéine de la membrane externe d’Escherichia coli. Cedomaine (tOmpA) forme un tonneau ? composé de huit brinsantiparallèles. Nous présenterons tout d'abord l’aspect biochimique de ce travail, i.e. la caractérisation des complexes tOmpA/détergent et tOmpA/amphipol et la mise au point des conditions permettant le maintien en solution de ces complexes aux concentrations élevées requises pour la RMN. Nous examinerons ensuite, par une étude de transfert d’énergie de fluorescence entre la protéine et un amphipol marqué, la stabilité de la couche de polymère associée à la pro téine. Enfin, nous présenterons et analyserons des cartes RMN de corrélation proton-azote des complexes tOmpA/détergent et tOmpA/amphipol. La comparaison de ces cartes permet de valider l’emploi des amphipols pour l'étude des protéines membranaires par spectroscopie RMN à haute résolution.

Lundi 21 juin 2004, 14h00, Salle de conférence de l'IBPC
Paulo Emanuel de Oliveira Marujo, UPR 9073, Régulation de l'expression génétique chez les microorganismes

"Polyadenylation et contrôle de la dégradation de l'ARN messager rpsO chez Escherichia coli"

Résumé :
Il y a de plus en plus d'évidences que la stabilité de l'ARNm est un des paramètres qui module l'expression des gènes. Le travail présenté dans cette thèse est une contribution à l'étude des mécanismes de la dégradation de l'ARN dans Escherichia coli.
Le modèle expérimental utilisé est l'ARNm rpsO codant la protéine ribosomale S15 dont nous savons déjà qu'il peut être dégradé par deux mécanismes. La voie dominante est déclenchée par une coupure endonucléolytique au site M2 situé entre le codon stop et la tige-boucle du terminateur transcriptionnel localisée à l'extrémité 3' de l'ARNm. En absence de la RNase E qui catalyse cette réaction et des exoribonucléases qui dégradent l'ARN maturé (la polynucléotide phosphorylase et la RNase II) l'ARNm rpsO est dégradé par un mécanisme qui dépend de sa polyadénylation.
De manière inattendue, des mutations du site reconnu par la RNase E, M2, qui empèchent le coupure initiale de la voie majeure de dégradation stabilisent très peu le transcrit rpsO. Nous démontrons que ceci est du au fait que les ARN dépourvus de site M2 deviennent plus sensibles à la voie de dégradation poly(A) dépendante. Il apparaît de plus que l'ARNm est coupé par la RNase E à d'autres sites localisés dans la phase de lecture. La dégradation très lente d'un ARN délété à proximité du site M2 nous a conduit à faire l'hypothèse que cette région est le site reconnu par la RNase E et le dégradosome.
Le dégradosome est un complexe multienzymatique contenant la RNase E, la polynucléotide phosphorylase, l'ARN hélicase RhlB et l'énolase. L'impossibilité de former ce complexe dans une souche synthétisant une RNase E tronquée, dépourvue de la région terminale à laquelle s'associent les composants du dégradosome, provoque une stabilisation très importante (8 fois) de l'ARNm rpsO (cette souche porte la mutation rne131). Nous montrons d'une part que cette mutation n'empèche pas la maturation de l'ARNm rpsO à M2 et d'autre part que cette stabilisation est corrélée avec une inhibition de l'efficacité de la dégradation poly(A) dépendante.
Nous avons également analysé le rôle de la traduction dans la dégradation de l'ARNm rpsO. Nos résultats indiquent que la fixation des ribosomes au site de démarrage de la traduction protègent l'ARN de la voie poly(A)-dépendante et que leur progression le long de la phase codante le met sous la dépendance de la voie de dégradation médiée par la RNase E. Nous concluons de ces expériences que la voie poly(A) dépendante prendrait en charge la dégradation des ARNm non traduits.
L'ARNm rpsO est adénylé par la poly(A) polymérase I et les queues poly(A) sont éliminées par la RNase II et la polynucléotide phosphorylase. Nous avons étudié le rôle de ces deux enzymes dans le métabolisme du poly(A). Nous montrons que la transcription se termine principalement in vivo à deux sites localisés 7 et 8 nucléotides en aval de la tige-boucle riche en G+C du terminateur transcriptionnel; à la même distanse que les sites de terminaison identifiès in vitro et que les transcrits primaires peuvent être soit grignotés par la RNase II soit allongés par la poly(A) polymérase. De plus, la RNase II peut complètement retirer les queues poly(A). Au contraire, la PNPase n'enlève que partiellement le poly(A); elle génère des molécules qui ont encore 3 à 4 A à leur extrémité 3'. Enfin la PNPase peut également passer au travers de la structure secondaire terminale du terminateur et dégrader le corps du message. Un modele est présenté dans lequel la RNase II élimine les queues poly(A) qui déstabilisent l'ARNm.

Vendredi 5 mars 2004, 14h30, Salle de conférence de l'IBPC
Isabelle NAVIZET, UPR 9080, Biochimie Théorique

"Modélisation et analyse des propriétés mécaniques des protéines"

Résumé :
Nous avons utilisé des outils de la modélisation moléculaire, et développé de nouvelles approches, pour l'étude des propriétés mécaniques des protéines. La première étude présentée concerne la mécanique de la myosine par l'analyse des modes normaux d'un modèle granulaire (GNM), où la protéine est représentée par un réseau de ressorts gaussiens. La comparaison des matrices de distance entre différentes structures cristallographiques permet une meilleure compréhension de sa structuration en domaine. La deuxième approche utilise une représentation en coordonnées internes pour étudier la réponse des protéines à des contraintes mécaniques globales, induisant un dépliement, et locales, permettant de définir l’élasticité à l’échelle du résidu. La contrainte locale développée permet aussi de donner des informations sur le couplage mécanique entre les résidus et de définir des domaines mécaniques. Cette approche avec un modèle granulaire permet une étude systématique de plusieurs protéines.

Jeudi 26 Février 2004, 15h, Salle de conférence de l'IBPC
Aziz El HAGE, UPR 9073, Régulation de l'expression génétique chez les microorganismes

"Protéines chaperons intervenant dans l'assemblage des ribosomes chez Escherichia coli"