Nous voulons comprendre comment fonctionnent les ARN hélicases, ce qui leur apporte leur spécificité, et comment elles sont régulées dans la cellule. Nous nous intéressons plus particulièrement aux protéines à boite DEAD, et nous utilisons la levure et les bactéries comme systèmes modèles.
Comment les “coeurs” catalytiques conservés de ces protéines fonctionnent-ils? Pour essayer de répondre à cette question, nous avons utilisé différentes hélicases et différentes approches complémentaires. Nous avons d’abord réalisé des alignements de séquences et avons modélisé les structures de ces protéines afin d’identifier les régions intéressantes. Puis, nous avons utilisé des approches génétiques pour analyser la fonctionnalité des protéines obtenues à partir des différentes constructions. Enfin, nous avons purifié ces protéines exprimées à partir de E. coli, afin de caractériser leurs propriétés enzymatiques in vitro : activité ATPase, affinité vis à vis d’un substrat ARN et capacité à dérouler un duplex ARN/ARN ou ARN/ADN.
Parmi ces hélicases, nous nous intéressons plus particulièrement à la protéine hélicase Ded1 de levure. C’est une protéine essentielle, relativement facile à purifier et qui possède une des meilleures activités in vitro. Elle est capable de dissocier un duplex ARN/ADN (50 fois en excès) de 18 paires de bases en moins de 5 minutes, avec une vitesse d’hydrolyse de 350 molécules d’ATP par minute. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de Ded1, nous avons commencé des études de type molécule unique (pinces optiques en molécule unique et FRET en molécule unique), en collaboration avec le Dr. Vincent Croquette à l’ENS. Nous avons également une collaboration avec le Dr. Ulrich Bockelmann à l’ESPCI à Paris, sur des hélicases bactériennes.

L’absence de spécificité de substrat et de régulation enzymatique in vitro nous a poussé à rechercher quelles sont les protéines partenaires de Ded1 qui pourraient jouer ces rôles. Nous avons réalisé des expériences de “pull down” à partir d’extraits de levure, et nous avons pu identifier les facteurs associés à Ded1. Ces résultats ont pu être confirmés par des expériences de co-immunoprécipitation réalisées à partir des protéines recombinantes purifiées. Enfin, nous avons pu co-localiser Ded1 avec ses partenaires dans des cellules de levure, en utilisant des protéines fusionnées à différentes étiquettes fluorescentes, en collaboration avec le Dr. Naïma Belgareh-Touzé à l’IBPC. Une recherche des substrats ARN spécifiques de Ded1 est en cours de réalisation.

Enfin, nous collaborons avec le Dr. Ikram Guizani de l’Institut Pasteur de Tunis, afin de trouver des agents biologiques actifs, spécifiques de la protéine à boite DEAD LeIF de Leishmania, un parasite protozoaire de la famille des Trypanosomatidés. Le Dr. Michael Nilges, de l’Institut Pasteur de Paris, a modélisé la structure tri-dimensionnelle de LeIF et il a identifié des cibles potentielles comme agents thérapeutiques. Le laboratoire du Dr. Hélène Munier-Lehmann, à Pasteur (Paris), testera ces agents sur l’activité de la protéine LeIF de Leishmania.
(Resp. Kyle Tanner)

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Notre équipe s'intéresse également à la méthylation de l’appareil traductionnel chez l’organisme modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae. Les techniques majeures utilisées sont la biologie moléculaire, la génétique, la biochimie des protéines, ainsi que la détermination de structures tridimensionnelles en collaboration avec des biologistes structuraux.
(Resp. Valérie Heurgué-Hamard)

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