"Cytotoxines anti-microorganismes, mécanismes de la traduction"

  

Resp : Miklos de Zamaroczy et Valérie Heurgué-Hamard

 

    La synthèse protéique est une étape fondamentale de l’expression des gènes, dont les études axées: 1) sur la terminaison de la traduction et 2) l’inhibition par les toxines, constituent l’essentiel de la recherche de notre laboratoire. La mise en évidence de la modification post-traductionnelle des facteurs de terminaison de la traduction d’E. coli, sur un motif conservé et essentiel à leur activité, est à la base de l’orientation actuelle de nos travaux vers la levure S. cerevisiae. Nous nous intéressons aux mécanismes de la traduction, tels que la biogenèse et le recyclage des ribosomes à travers l’étude de la méthylation de eRF1, mais également aux interactions protéiques liées à la terminaison et à la stabilité des ARNm. Chez les procaryotes, la synthèse protéique peut être spécifiquement inhibée par des toxines à activité RNase, affectant l’ARN ribosomique 16S (colicine E3) ou certains ARN de transfert (colicine D). Nous avons montré l’existence d’une étape de maturation de la colicine D nécessaire à sa toxicité dans les cellules cibles. Nous développons maintenant l’aspect mécanistique de l’import et de la toxicité, ainsi que l’immunité des cellules productrices de toxine.

    Notre équipe accueille sur le plan administratif la thématique "Protéines chaperonnes et biogénèse du ribosome" dont le responsable scientifique autonome est Jean-Hervé Alix (MCHC)

   

De gauche à droite : Emmeline Huvelle, Valérie Heurgué-Hamard, Sylvain Roque, Liliana Mora, Jean-Hervé Alix, Miklos de Zamaroczy, Stephanie Kervestin-Yates

 

    

 

IMPORT, MECANISME D'ACTION ET IMMUNITE DES CYTOTOXINES ANTI-BACTERIENNES

Miklos de ZAMAROCZY (DR2/CNRS), Liliana MORA (IE1/CNRS)

     Notre recherche est centrée sur l’étude des membranes biologiques des bactéries Gram- et l’étape de translocation des cytotoxines à travers celles-ci, nécessaire à leur entrée dans la cellule cible. Nous cherchons à élucider également le mode d’action de ces toxines, notamment de celles qui ont une activité nucléase. Nous incluons dans notre recherche l’analyse du mécanisme moléculaire de la protection (immunité) de la cellule productrice de toxine, contre sa propre toxine et contre la toxine exogène. Les cellules « colicinogènes » produisent en plus de la colicine une protéine dite d'immunité (Imm).

     Les colicines produites par E. coli sont actives sur des souches sensibles d'entérobactéries. Elles tuent sélectivement des bactéries en compétition pour la survie. La colicine B forme des pores dans la membrane interne, alors que la colicine D clive les ARN de transfert-Arg dans le cytoplasme de la cellule cible. Elles sont représentatives des deux modes d’action majeurs des colicines. Les colicines de type nucléase forment un complexe inactif de haute affinité avec leur protéine d’immunité. Le complexe ainsi formé sera libéré dans le milieu extérieur. Les deux colicines parasitent la machinerie cellulaire d'une manière similaire. Pour traverser la membrane externe elles détournent de leur activité physiologique le récepteur FepA (transporteur du fer chélaté) et le système TonB/ ExbB-D, nécessaire à la transduction de la force proton motrice de la membrane interne vers des récepteurs de la membrane externe. Le transport actif est assuré grâce à l’interaction de la protéine TonB avec le motif protéique, appelé TonB box, du récepteur.

Translocation de la colicine D à travers la membrane externe

     Nous avons mis en évidence une interaction spécifique du « TonB box »-consensus de la colicine B ou de la colicine D, avec le domaine central de la protéine TonB, responsable de la transduction d'énergie. Cette interaction site spécifique qui a lieu pendant l’import de la colicine est distincte de celle du récepteur avec TonB, mais elle est également indispensable à l'extraction de la cytotoxine de son récepteur vers le périplasme (Mora et al., 2005).

Translocation de la colicine D à travers la membrane interne

Nous avons montré que la signal-peptidase LepB est essentielle à l’activité tueuse de la colicine D, mais non à la cytotoxicité des autres colicines. LepB s’est avérée indispensable pour la coupure endoprotéolytique de la colicine D in vitro, même si seule (en l’absence d’extrait périplasmique) elle n’est pas suffisante pour effectuer cette coupure. Notre démarche a permis de postuler l’existence d’une étape tardive de la pénétration des colicine-nucléases dans les cellules sensibles, qui consiste à libérer le domaine catalytique C-terminal dans le cytoplasme, à la suite d’un clivage intramoléculaire (processing) de la colicine. Pendant la production de la colicine, son interaction avec la protéine d’immunité masque non seulement l’activité nucléase létale, mais masque aussi le site du clivage, localisé in vitro en amont du domaine cytotoxique (de Zamaroczy et al., 2001, de Zamaroczy and Buckingham, 2002).

Implication du domaine central de la colicine D dans l’import dépendant du système TonB

     Nous avons montré que la spécificité de l'interaction de TonB avec le TonB box consensus de colicine D ou de la colicine B est également dépendante du 8ème résidu du peptide flexible, qui se trouve juste en amont mais à l’extérieur du TonB box. L'étude de molécules de colicines partiellement délétées ou de chimères formées entre les colicines B et D, a mis en évidence une nouvelle interaction spécifique, impliquant la protéine TonB et le domaine central de la colicine D (W377- E421). L’ensemble de nos résultats montre que la formation des complexes de haute affinité pendant l’import nécessite une suite d’interactions entre la colicine, le récepteur et TonB (Mora et al., 2008).

Inhibition de l’activité tRNase de la colicine D par la fixation de la protéine d’immunité imitant le substrat

     Un modèle moléculaire du mécanisme de catalyse de la tRNase antibactérienne colicine D et de son inhibition a été établi, grâce à la structure cristallographique à 2Å du complexe [domaine tRNase C-terminal /protéine d'immunité] et à une étude génétique approfondie. Aucun des deux composants ne montre d’homologie structurale avec des RNases connues ou avec leurs inhibiteurs. Contrairement à d'autres complexes caractérisés de type nucléase-colicine/protéine d’immunité, la poche du site actif de la colicine D est structuralement bloquée par ImmD. ImmD, en opposant un groupe de résidus chargés négativement à un groupe de résidus du site actif, chargés positivement et localisés à la surface de la colicine D, « imite » ainsi les phosphates du squelette du tRNAArg (substrat). Grâce à de nombreuses mutations ponctuelles dirigées, qui affectent soit le domaine catalytique, soit la protéine d'immunité, nous avons identifié in vitro et in vivo les résidus vitaux nécessaires à la reconnaissance du substrat, à l'activité catalytique et à l'interaction neutralisant la colicine D par ImmD (Graille et al., 2004).

     Plus récemment, nous avons obtenu la preuve que le domaine central de la colicine D participe aussi à la formation du complexe immun pendant la sécrétion de la toxine. Le domaine central pourrait ainsi contacter l’hélice ?4, qui se trouve à l’opposé de la surface d’ImmD interagissant avec le domaine catalytique. Ce second site d’interaction avec ImmD n’est pas nécessaire pour inactiver le domaine catalytique « isolé », correspondant à une forme tronquée de la colicine D, supposée parvenir seule jusqu’au cytoplasme à la fin de l’import dans la cellule cible.

    

 

Formation of the immunity complex between ImmD and the central and C-terminal domains of colicin D. MIS (the major interaction surface) is formed by the active site of the tRNase domain of colicin D and helices α2 and α3 of ImmD. SIS (the secondary interaction surface) may be formed by the central domain (CD) of colicin D and helix α4 of ImmD (Mora et al., 2008).

Les protéines chaperonnes et la biogénèse des ribosomes

        

Jean-Hervé ALIX, Abdalla AL REFAII et Olivier RENE

     Les protéines chaperonnes DnaK (HSP70) et GroEL (HSP60), omniprésentes et universelles, interviennent dans de nombreux assemblages et désassemblages macromoléculaires (Alix (2004) The Work of Chaperones), et notamment dans les étapes TARDIVES de la biogénèse des sous-unités ribosomiques 30S et 50S d’Escherichia coli. Leur absence ralentit, ou même selon la température peut bloquer, cet assemblage au niveau de particules ribosomiques 21S (PRECURSEURS des sous-unités 30S), ainsi que de particules 32S et 45S (PRECURSEURS des sous-unités 50S). Il s’agit là de réels précurseurs, qui peuvent être ultérieurement convertis en sous-unités 30S et 50S actives. DnaK n’est donc pas strictement nécessaire à la biogénèse des ribosomes mais l’accélère considérablement à haute température (El Hage and Alix, 2004). Les précurseurs 21S contiennent un ARNr 16S totalement non maturé, ou partiellement maturé du coté 5’ mais non du coté 3’, ce qui démontre que le processus de maturation de l’ARNr 16S est séquentiel (Al Refaii and Alix, 2009). DnaK pourrait donc être une cible pour rechercher au sein d’une chimiothèque des molécules inhibitrices de la biogénèse des ribosomes bactériens, et pour cela un crible simple existe (Al Refaii and Alix, 2008). En tout cas, un couplage via DnaK entre le contrôle de la QUALITE des protéines et la biogénèse des ribosomes peut être postulé, comme décrit dans ce schéma.

 

Publications

 

EL HAGE, A., SBAI, M. and ALIX, J.H. (2001) " The chaperonin GroEL and other heat-shock proteins, besides DnaK, participate in ribosome biogenesis in Escherichia coli. " Mol. Gen. Genet 264 , 796-808.

LOPES FERREIRA, N. and ALIX, J.H. (2002) "The DnaK chaperone is necessary for alpha-complementation of beta-galactosidase in E.coli" J.Bacteriol 184, 7047-7054.

ALIX, J.H. and NIERHAUS K.H. (2003), "DnaK-facilitated ribosome assembly in Escherichia coli revisited" RNA 9, 787-793.

EL HAGE, A. and ALIX, J.H. (2004) "Authentic precursors to ribosomal subunits accumulate in Escherichia coli in the absence of functional DnaK chaperone" Mol.Microbiol 51, 189-201.

ALIX, J.H. (2004) The Work of Chaperones . In :"Protein Synthesis and Ribosome Structure" K.Nierhaus and D.Wilson,eds. Wiley-VCH Verlag . pp.529-562.

SUPPINI, J.P. AMOR, M., ALIX, J.H. and LADJIMI, M. (2004) Complementation of anE.coli DnaK defect by HSC70-DnaK chimeric proteins." J.Bacteriol 186, 6248-6253."

Al Refaii, A., and Alix, J.H. (2008) Inhibition of chaperone-dependent bacterial ribosome biogenesis. Methods Mol Med 142: 75-85.

Al Refaii, A., and Alix, J.H. (2009) temperature-dependent and delayed in E. coli lacking the chaperones DnaK or DnaJ. Mol Microbiol 71: 748-762

René, O. & Alix, J.-H. (2011) Late steps of ribosome assembly in E.coli are sensitive to a severe heat stress but are assisted by the HSP70 chaperone machine. Nucl. Acids Res. 39(5): 1855-67.

Contrats ANR - Programme non thématique "blanc"

Projet: « Structural and functional studies of multiprotein complexes involved in the degradation of normal and aberrant mRNAs »

Coordinateur: Richard BUCKINGHAM (UPR 9073)

Période: 2006 - 2009

Montant: 240000 euros TTC (quote-part UPR 9073: 120000 euros TTC)

    

Contrat ANR - Programme "Jeunes chercheuses - Jeunes chercheurs "

Projet: « Function of yeast eRF1 methyltransferase in translation termination and mRNA decay »

Responsable scientifique : Valérie HEURGUE-HAMARD (UPR 9073)

Période: 2007 - 2010

Montant: 150000 euros TTC

Contrat - Research Grant from Human Frontier Science Program

Projet:« Promotion of NMD by mechanistic differences between premature and normal translation termination »

Coordinateur: Allan JACOBSON (University of Massachusetts, Worcester, USA),

Responsable scientifique suédois: Måns EHRENBERG (University of Uppsala, Sweden)

Responsable scientifique français: Herman van TILBEURGH (IBBMC, UMR 8619, CNRS)

Période: 2009 - 2012

Montant: 350000 $ TTC (quota-part UPR 9073: 100000 euros TTC)

Publications 2000-2012

2012

Figaro, S., Wacheul, L., Schillewaert, S., Graille, M., Huvelle, E., Mongeard, R., Zorbas, C., Lafontaine, D., Heurgué-Hamard, V (2012) Trm112 is required for Bud23-mediated methylation of the 18S rRNA at position G1575. Mol Cell Biol, in press, doi:10.1128/MCB.06623-11

Graille M, Figaro S, Kervestin S, Buckingham RH, Liger D, Heurgué-Hamard V. (2012) Methylation of class I translation termination factors: Structural and functional aspects, Biochimie, in press, doi:10.1016/j.biochi.2012.01.005

Kervestin S, Li C, Buckingham R, Jacobson A. (2012) Testing the faux-UTR model for NMD: Analysis of Upf1p and Pab1p competition for binding to eRF3/Sup35p. Biochimie, in press, doi:10.1016/j.biochi.2011.12.021

2011

Chauleau, M., Mora, L., Serba, J. and de Zamaroczy, M. (2011) FtsH-dependent processing of the RNase colicins D and E3 means that only the cytotoxic domains are imported into the cytoplasm. J. Biol Chem. 286, 29397-29407.

Dreyfus, M. & Heurgué-Hamard, V. (2011) Termination troubles in Escherichia coli K12. Mol. Microbiol. 79, 288-291.

Dominique Liger, D., Mora, L., Lazar, N., Figaro, S; Henri, J., Scrima, N., Buckingham R.H., van Tilbeurgh, H., Heurgué-Hamard, V & Graille, M (2011) Mechanism of activation of methyltransferases involved in translation by the Trm112 „hub‰ protein  Nucleic Acids Research, sous presse

de Zamaroczy, M., and Chauleau, M. (2011). Colicin killing: foiled cell defense and hijacked cell functions. In Procaryotic antimicrobial peptides: from genes to applications, D. Drider and S. Rebuffat, eds. Chapter 14, (Springer Science Media, Springer New York, London), pp. 255-288.

2009

Diago-Navarro, E., Mora, L., Buckingham, R.H., Díaz-Orejas, R. & Lemonnier, M. (2009) Novel Escherichia coli RF1 mutants with decreased translation termination activity and increased sensitivity to the cytotoxic effect of the bacterial toxins Kid and RelE. Mol. Microbiol. 71, 66-78.

2008
Figaro, S., Scrima, N., Buckingham, R.H. & Heurgué-Hamard, V. (2008) HemK2 protein, encoded on human chromosome 21, methylates translation termination factor eRF1. FEBS Lett. 582, 2352-2356.

Mora, L., Klepsch, M., Buckingham, R.H., Heurgué-Hamard, V., Kervestin, S. & de Zamaroczy, M. (2008) Dual roles of the central domain of colicin D tRNase in TonB-mediated import and in immunity. J Biol Chem. 283, 4993-5003.

2007
Mora, L., Heurgue-Hamard, V., de Zamaroczy, M., Kervestin, S. and Buckingham, R. H. (2007) Methylation of bacterial release factors RF1 and RF2 is required for normal translation termination in vivo. J. Biol. Chem. 282, 35638-35645.

2006
Heurgué-Hamard, V., Graille, M., Scrima, N., Ulryck, N., Champ, S., van Tilbeurgh, H. and Buckingham, R. H. (2006) The zinc-finger protein Ynr046w is plurifunctional and a component of the eRF1 methyltransferase in yeast. J. Biol. Chem. 281, 36140-36148.

Amrani, N., Dong, S., He, F., Ganesan, R., Ghosh, S., Kervestin, S., Li. C., Mangus, D. A., Spatrick, P., & Jacobson, A. (2006) Aberrant termination triggers nonsense-mediated mRNA decay. Biochem Soc. Trans. 34, 39-42.

2005
Vestergaard, B., Sanyal, S., Roessle, M., Mora, L., Buckingham, R. H., Kastrup, J. S., Gajhede, M., Svergun, D. I. and Ehrenberg, M. (2005) The SAXS solution structure of RF1 differs from its crystal structure and is similar to its ribosome-bound cryo-EM structure. Molecular Cell, 20, 929-38.

Graille, M., Heurgué-Hamard, V., Champ, S., Mora, L., Scrima, N., Ulryck, N., van Tilbeurgh, H. & Buckingham, R.H. (2005) Molecular basis for bacterial class I release factor methylation by PrmC. Mol. Cell, 20, 917-927.

Heurgue-Hamard, V., Champ, S., Mora, L., Merkulova-Rainon, T., Kisselev, L. L., and Buckingham, R. H. (2005). The glutamine residue of the conserved GGQ motif in Saccharomyces cerevisiae release factor eRF1 is methylated by the product of the YDR140w gene. J. Biol. Chem. 280, 2439-2445.

Pannekoek, Y., Heurgue-Hamard, V., Langerak, A. A., Speijer, D., Buckingham, R. H., and van der Ende, A. (2005) The N5-glutamine S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase PrmC/HemK in Chlamydia trachomatis methylates class 1 release factors. J. Bacteriol. 187, 507-511.

Mora, L., Diaz, N., Buckingham, R. H., and de Zamaroczy, M. (2005) Import of the transfer RNase colicin D requires site-specific interaction with the energy-transducing protein TonB. J. Bacteriol. 187, 2693-2697.

2004
Amrani, N., Ganesan, R., Kervestin, S., Mangus, D. A., Ghosh, S., & Jacobson, A. (2004) A faux 3'-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mRNA decay. Nature, 432, 112-118.

Graille, M., Mora, L., Buckingham, R.H., Van Tilbeurgh, H. & de Zamaroczy, M. (2004) Structural inhibition of the colicin D tRNase by the tRNA-mimicking immunity protein. EMBO J. 23, 1474-82.

2003
Mora, L., Heurgué-Hamard, V., Champ, S., Ehrenberg, M., Kisselev, L. & Buckingham, R.H. (2003) The essential role of the invariant GGQ motif in the function and the stability in vivo of bacterial release factors RF1 and RF2. Mol. Microbiol. 47, 267-275.

Mora, L., Zavialov, A.V., Ehrenberg, M. & Buckingham, R.H. (2003) Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RF1 and RF2 from Escherichia coli. Mol. Microbiol. 50, 1467-1476.

2002
Heurgué-Hamard, V., Champ, S., Engstöm, Å., Ehrenberg, M. & Buckingham, R.H. (2002) The hemK gene in Escherichia coli encodes the N(5)-glutamine methyltransferase that modifies peptide release factors. EMBO J. 21, 769-778.

Menez, J., Buckingham, R.H., de Zamaroczy, M. & Karmazyn-Campelli, C. (2002) Peptidyl-tRNA hydrolase in Bacillus subtilis, encoded by spoVC, is essential to vegetative growth, whereas the homologous enzyme in Saccharomyces cerevisiae is dispensible. Mol. Microbiol. 147, 1581-1589.

Zavialov, A.V., Mora, L., Buckingham, R.H. & Ehrenberg, M. (2002) Release of peptide promoted by the GGQ-motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Molecular Cell, 10, 789-798.

de Zamaroczy, M. & Buckingham, R.H. (2002) Importation of nuclease colicins into E. coli cells: endonucleolytic cleavage and its prevention by the immunity protein. Biochimie, 84, 423-432.

2001

de Zamaroczy, M., Mora, L., Lecuyer, A., Geli, V. & Buckingham, R.H. (2001) Cleavage of colicin D is necessary for cell killing and requires the inner membrane peptidase LepB. Molecular Cell, 8, 159-168.


2000

Heurgué-Hamard, V., Dincbas, V., Buckingham, R.H. & Ehrenberg, M. (2000) Origins of minigene-dependent growth inhibition in bacterial cells. EMBO J. 19, 2701-9.

Dinçbas-Renqvist, V., Engström, Å., Mora, L., Heurgué-Hamard, V., Buckingham, R.H. & Ehrenberg, M. (2000) A post-translational modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J. 19, 6900-6907.

Menez, J., Heurgue-Hamard, V. & Buckingham, R.H. (2000) Sequestration of specific tRNA species cognate to the last sense codon of an overproduced gratuitous protein. Nucleic Acids Res. 28, 4733-4741.

Anciens membres

2000 – 2001 : Aurélie Lecuyer, 9 mois, Master 2, Université Paris 6 (UPMC)

2002 : Nancy Diaz, 6 mois, stage de licence (L3), Université Montpellier II

2004 : Agnès Hebert, 5 mois, stage de licence (L3), Université Paris 7 (UDD)

1998 - 2004 : Stéphanie Champ, AI / CNRS

2005 : Loïc ROCTON, 4 mois, stage Master 1, Université Paris 6 (UPMC)

2005 : Mirjam Klepsch, 5 mois, Master 2, ERASMUS, Université de Bayreuth, Allemagne

2008 : Kevin Fidelin, 2 mois, stage de BTS, ENCPB Paris

2008 : Aurélie Floch, 2 mois, stage de licence (L3), Université Paris 7 (UDD)

2005 - 2008 : Nathalie Scrima, TCN / CNRS

2006 - 2009 : Sabine Figaro, Doctorat d’Université Paris 6 (UPMC)

2010 : Sabine Figaro, CDD IR

2009 : Richard Buckingham, DR1 émérite CNRS

2009 : Isabelle Gaugué, 1 an, CDD / ITA - ANR

2009 : Rémi Mongeard, 1 an, CDD / ITA - ANR

2010 : Meryl Pollion, 3 mois, Master 1, Université Paris 6 (UPMC)

2010 : Justyna Serba, 6 mois, Master 2, ERASMUS, Université de Poznan, Pologne

2011 : Hanna Kasprzak, 6 mois, Master 2, ERASMUS, Université de Poznan, Pologne

2010-2011: Marie Cerciat , 16 mois, CDD / ITA HFSP

2009 - 2011 : Mathieu Chauleau, Doctorat d’Université Paris 11 (ED GGC)