UMR8261 Expression Génétique Microbienne

CNRS / Université Paris Diderot Paris 7

Directeur : Harald Putzer, Directeur-adjoint : Ciarán Condon

  • les hélicases
  • leur importance
  • notre projet
  • l'équipe
  • collaborations
  • financement
  • publications
  • V. Heurgué-Hamard

 

Hélicases à ARN : leurs structures, fonctions et leurs propriétés

 

Resp: N. Kyle Tanner Ph.D., DR-CDI CNRS

Tél: (33) 1 58 41 52 37
FAX: (33) 1 58 41 50 25
E-mail: kyle.tanner@ibpc.fr
Addresse: Pièce123
Institut de Biologie Physico-Chimique (IBPC)
13 rue Pierre et Marie Curie
75005 Paris France

  Actualités : Depuis janvier 2014, nous avons accueilli Valérie Heurgué-Hamard dans notre groupe. Son projet de recherche concerne l’étude de la méthylation de l’appareil traductionnel l (ribosome, facteurs de traduction et ARNs de transfert). Ce travail s’appuie sur des études fonctionnelles et structurales chez la levure Saccharomyces cerevisiae.

Qu’est ce qu’une ARN hélicase ?


  ARN hélicase est un terme générique désignant un ensemble de familles de protéines appartenant aux superfamilles (SF) de protéines NTP-dépendantes. Elles sont impliquées dans la maturation de l’ARN, la réplication, la réparation de l’ADN, l’expression et le remodelage des complexes d’acides nucléiques. On connait au moins 7 de ces superfamilles qui utilisent soit l’ARN soit l’ADN comme substrat. Elles sont caractérisées par des motifs de liaison aux nucléotides qui sont très conservés. Les “coeurs catalytiques” de ces protéines sont constitués de feuillets beta parallèles entourés d’hélices. On les nomme domaine de type RecA car cette structure est similaire à celle de la protéine RecA, qui joue un rôle dans la recombinaison homologue chez E. coli. La majorité des protéines de ces superfamilles contiennent un seul domaine de type RecA, tandis que les familles de type SF1 et SF2 ont deux domaines de ce type reliés par un "linker". La vaste majorité des hélicases à ARN appartient à la famille SF2, mais quelques unes d’entre elles font toutefois partie de la famille SF1.

 

Fig. 1. Modélisation de la structure de l’hélicase à boite DEAD de levure, Ded1p, avec ses deux domaines de type RecA (résidus 117-529), réalisée à partir de la structure de Vasa, une protéine très proche de Ded1 (coordonnées pdb 2db3, Sendogu et al, 2006, Cell 125:287-300). Les ligands (AMP-PNP, Mg2+ et ARN U2-U6) ont été positionnés comme dans Vasa.

ARN hélicases: Que font elles?

   Les ARN hélicases utilisent l’énergie libérée par la liaison et par l’hydrolyse des nucléotides tri-phosphates. La plupart d’entre elles utilisent l’ATP ou le dATP comme source d’énergie, mais certaines peuvent utiliser l’UTP, le CTP ou le GTP. Même si on les appelle des “hélicases”, elles peuvent avoir bien d’autres activités. Par exemple, la protéine RIG-1 (retinoic acid-inducible protein) et la protéine MDA5 (melanoma differentiation-associated protein 5) reconnaissent l’ARN double brin produit lors des infections virales et peuvent activer les réseaux de signalisation antivirale. De même, la protéine SecA est un cofacteur du complexe bactérien SecYEG qui est impliqué dans la translocation des polypeptides à travers la membrane. D’autres ARN hélicases fonctionnent comme ARN chaperones capables de faciliter la formation d’ARNs fonctionnels, ou comme RNPases capables de dissocier les protéines liées à l’ARN, ou encore comme protéines d’assemblage capables de faciliter la formation de complexes ribonucléoprotéiques fonctionnels. Enfin, il a été montré que certaines hélicases peuvent dérouler des duplexes ARN-ARN ou ARN-ADN.

 

ARN hélicases: Pourquoi sont-elles importantes?

   Les hélicases à ARN existent dans toutes les formes de vie, des bactéries aux eucaryotes supérieurs. Même les virus, comme HCV, codent pour leurs propres ARN hélicases, même s'ils utilisent également les hélicases de leurs hôtes. Les ARN hélicases sont associées à tous les processus impliquant l’ARN: transcription, épissage, transport, contrôle qualité, traduction et dégradation. De nombreuses hélicases sont essentielles et elles sont rarement interchangeables, ce qui indique leur fort degré de spécialisation dans les cellules. De ce fait, on les retrouve impliquées dans de nombreux processus biologiques, tels que le cycle cellulaire, le développement, le cancer, le vieillissement, les désordres neurologiques et d’autres maladies. Ce sont donc des cibles potentielles qui pourraient être utilisées comme agents prophylactiques et thérapeutiques.

ARN hélicases: Qui sont-elles?

   Les ARN hélicases à boite DEAD ne peuvent lier l’ARN qu'en présence d’ATP, et sont capables d’hydrolyser l’ATP qu'en présence d’ARN. Elles constituent la plus grande famille d’ARN hélicases, et appartiennent à la famille SF2 qu’on appelle souvent la super-famille des protéines à boite DExD/H. On les retrouve pratiquement chez tous les organismes: la levure Saccharomyces cerevisiae en possède 25 et on en trouve 5 chez la bactérie Escherichia coli. Chez la levure, la plupart de ces protéines sont essentielles et non interchangeables. Chez E. coli, elles ne sont pas essentielles individuellement dans les conditions de culture de laboratoire. Elles sont impliquées dans tous les processus indiqués ci-dessus. Ce sont en général d’assez mauvaises hélicases in vitro, qui ne sont capables de dérouler que des duplexes d’ARN de relativement petites tailles (une douzaine de paires de bases). De plus, ces protéines ne présentent aucune directionalité ni processivité in vitro. On pense que ce sont leurs partenaires protéiques qui leurs confèrent directionalité et processivité in vivo.
   Les protéines à boite DEAD sont caractérisées par la présence de 9 motifs conservés qui jouent un rôle dans la liaison avec les ligands et qui leurs confèrent leur activité enzymatique. Leur nom vient des acides aminés caractéristiques du motif II (Asp-Glu-Ala-Asp), soit D-E-A-D. Cependant, il existe des protéines appartenant à la famille des hélicases à boite DEAD qui ont une séquence différente pour le motif II, et des protéines qui ont un vrai motif II mais qui ne font pas partie de cette famille. Les hélicases à boite DEAD sont caractérisées par d’autres marques, en particulier par le motif “Q” que nous avons découvert et caractérisé.

Fig. 2: Représentation schématique du “coeur” des protéines à boite D-E-A-D, montrant les 9 motifs conservés. Les positions des résidus qui interagissent avec les deux ligands, l’ARN et l’ATP (d’après la comparaison de plusieurs structures indépendantes) sont également représentées. Les flèches indiquent que le “coeur” se prolonge souvent par des extensions N- et C- terminales. Le “P” souligné indique une interaction avec un phosphate.

 

ARN hélicases: Notre projet

  Nous voulons comprendre comment fonctionnent les ARN hélicases, ce qui leur apporte leur spécificité, et comment elles sont régulées dans la cellule. Nous nous intéressons plus particulièrement aux protéines à boite DEAD, et nous utilisons la levure et les bactéries comme systèmes modèles.

  Comment les “coeurs” catalytiques conservés de ces protéines fonctionnent-ils? Pour essayer de répondre à cette question, nous avons utilisé différentes hélicases et différentes approches complémentaires. Nous avons d’abord réalisé des alignements de séquences et avons modélisé les structures de ces protéines afin d’identifier les régions intéressantes. Puis, nous avons utilisé des approches génétiques pour analyser la fonctionnalité des protéines obtenues à partir des différentes constructions. Enfin, nous avons purifié ces protéines exprimées à partir de E. coli, afin de caractériser leurs propriétés enzymatiques in vitro: activité ATPase, affinité vis à vis d’un substrat ARN et capacité à dérouler un duplex ARN/ARN ou ARN/ADN.

  Parmi ces hélicases, nous nous intéressons plus particulièrement à la protéine hélicase Ded1 de levure. C’est une protéine essentielle, relativement facile à purifier et qui possède une des meilleures activités in vitro. Elle est capable de dissocier un duplex ARN/ADN (50 fois en excès) de 18 paires de bases en moins de 5 minutes, avec une vitesse d’hydrolyse de 350 molécules d’ATP par minute. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de Ded1, nous avons commencé des études de type molécule unique (pinces optiques en molécule unique et FRET en molécule unique), en collaboration avec le Dr. Vincent Croquette à l’ENS. Nous avons également une collaboration avec le Dr. Ulrich Bockelmann à l’ESPCI à Paris, sur des hélicases bactériennes.

  L’absence de spécificité de substrat et de régulation enzymatique in vitro nous a poussé à rechercher quelles sont les protéines partenaires de Ded1 qui pourraient jouer ces rôles. Nous avons réalisé des expériences de “pull down” à partir d’extraits de levure, et nous avons pu identifier les facteurs associés à Ded1. Ces résultats ont pu être confirmés par des expériences de co-immunoprécipitation réalisées à partir des protéines recombinantes purifiées. Enfin, nous avons pu co-localiser Ded1 avec ses partenaires dans des cellules de levure, en utilisant des protéines fusionnées à différentes étiquettes fluorescentes, en collaboration avec le Dr. Naïma Belgareh-Touzé à l’IBPC. Une recherche des substrats ARN spécifiques de Ded1 est en cours de réalisation.

  Enfin, nous collaborons avec le Dr. Ikram Guizani de l’Institut Pasteur de Tunis, afin de trouver des agents biologiques actifs, spécifiques de la protéine à boite DEAD LeIF de Leishmania, un parasite protozoaire de la famille des Trypanosomatidés. Le Dr. Michael Nilges, de l’Institut Pasteur de Paris, a modélisé la structure tri-dimensionnelle de LeIF et il a identifié des cibles potentielles comme agents thérapeutiques. Le laboratoire du Dr. Hélène Munier-Lehmann, à Pasteur (Paris), testera ces agents sur l’activité de la protéine LeIF de Leishmania.

 

Membres

 

N. Kyle Tanner Ph.D, DR-CDI CNRS
Josette Banroques Ph.D, CR1 CNRS, VAC
Thierry Bizebard Ph. D, CR1 CNRS
Valérie Heurgué-Hamard Ph. D, CR1 CNRS
Caroline_Lacoux Post-Doc ANR
Emmeline Huvelle T CNRS
Molka Mokdadi Etudiante en thèse (Institut Pasteur, Tunis) cotutelle : Kyle Tanner, Ikraim Guizani (Institut Pasteur, Tunis)
Hilal Yeter Etudiante en thèse
Yosser Zina Abdelkrim-Guediche étudiante en thèse (Institut Pasteur Tunis) co-direction : Kyle Tanner et Ikraim Guizani (Institut Pasteur Tunis)
  Marine Pasquier 2eme année BTS, ESTBA, Paris

Alumni:

 

Emeline Coleno, IE CDD

Samar Hodeib, étudiante en thèse, en co-direction avec Vincent Croquette

Oznur Ozturk, Etudiante Licence L3, Université Paris 13

Robin Liset, 1ere année BTS, ESTBA, Paris

Guillaume Sevin, stage 2nde année BTS

Amar Baahmed, stage 2nde année BTS

Bruna Frota de Carvalho, MD, étudiante stagiaire

Agnès Le Saux, IR

Jinane Ait Benkhali Post-Doc

Yosser Zina ABDELKRIM Ep GUEDICHE, stagiaire, étudiante en thèse Institut Pasteur Tunis

Olivier Cordin, Post-Doc

Diogo Mendonça, M2 Erasmus

Lucas Rousselet, BTS 1ere année

Richard H. Buckingham, Ph.D., DR1 CNRS directeur émérite

Marc Dreyfus, Ph.D., DR1 CNRS, émérite associé à l' UMR7141 depuis jan 2014

Meriem Senissar, étudiante en thèse

Céline Adam, Assistant Ingénieur

Viriya OK, étudiante stagiaire IUT

Mathilde Bercy, étudiante en M2, en association avec Dr. Ulrich Bockelmann.

Hala Bounihi, Assistant Ingénieur

Gwendoline Cartier, étudiante en thèse

 

Financement


En dehors du CNRS, qui soutient solidement la UMR8261 du CNRS et qui emploie J. Banroques, K. Tanner, V. Heurgué-Hamard, E. Huvelle et T. Bizebard, et de l’Université Paris VII, l’équipe bénéficie des contrats suivants:


- ANR “programme blanc”: Contrat HelicaRN (Ref. 2010-BLAN-1503 01). Coordinateur: Marc Dreyfus avec Ulrich Bockelmann. (2010-2014).

- ANR grant TrMTase (n°ANR-14-CE09-0016-01). Coordinateur: Valérie Heurgué-Hamard, en partenariat avec Marc Graille (2015-2017)


- Contrat Pierre-Gilles de Gennes / Fondation pour la recherche (2012-2013). Titre du projet:”RNA helicases at work in single-molecule assays”. Coordinateur : Vincent Croquette avec N. Kyle Tanner, Hervé Le Hir et Jean-Baptiste Boulé.


- Initiative d’excellence DYNAMO (ANR-11-LABX-0011-01).


- ANR “programme blanc”: Contrat HeliDEAD (ANR-13-BSV8-0009-01). Coordinateur : N. Kyle Tanner avec Vincent Croquette et Naïma Belgareh-Touzé (2014-2016).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Publications marquantes depuis 2000

 

Méthylation de l’appareil traductionnel

 

  Notre travail porte sur la méthylation de l’appareil traductionnel. Nous travaillons chez l’organisme modèle eucaryote Saccharomyces. cerevisiae. Les techniques majeures utilisées sont la biologie moléculaire, la génétique, la biochimie des protéines, ainsi que la détermination de structures tridimensionnelles en collaboration avec des biologistes structuraux.

  L’appareil traductionnel (ribosome, facteurs de traduction et ARNs de transfert) est la cible de nombreuses modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles. La méthylation est une des modifications les plus courantes et de nombreuses protéines catalysent le transfert d’un groupement méthyle de la S-adénosylméthionine vers un substrat donné. Chez l’homme, un tiers de ces méthyltransferases (MTases) ont été liées au cancer ou à des maladies mentales. Cependant, leurs fonctions biologiques restent encore largement méconnues.

  Notre projet vise à mieux comprendre les fonctions biologiques de la méthylation des ARN et des protéines. Nous nous intéressons plus particulièrement à la protéine Trm112 de S. cerevisiae, qui active quatre méthyltransferases (MTases) ayant des substrats très différents, et qui se trouve à l’interface entre la synthèse du ribosome et sa fonction dans la traduction. Nous souhaitons élucider les fonctions de ces MTases en interaction avec Trm112.

  Nous avons montré que les facteurs de terminaison de la traduction de classe 1 sont méthylés chez les procaryotes (Escherichia coli, Chlamydia trachomatis), mais aussi dans le règne eucaryote (Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Mus musculus). Ces protéines sont essentielles à la libération d'une protéine fonctionnelle lorsque le ribosome rencontre un codon stop sur l’ARNm en cours de traduction.

  La méthylation se fait sur le résidu Gln du motif Gly-Gly-Gln (GGQ) conservé et impliqué dans la catalyse au centre de transfert peptidique du ribosome. Nous avons identifié les méthyltransférases impliquées dans ce processus, caractérisé leur fonction et leur structure (pour revue voir Graille et al., 2012).

 

Purification de complexes protéiques
Méthylation in vitro: cinétiques et fixation de la SAM
Structure de la méthyltransférase du facteur de terminaison eRF1 : le complexe Mtq2-Trm112
(Collaboration avec Marc Graille, Ecole Polytechnique, Palaiseau)

  Grâce à des approches génétiques et biochimiques, nous avons caractérisé le mécanisme de ces MTases et de la protéine activatrice Trm112 (Heurgué-Hamard et al., 2006, Liger et al., 2011).

  Trm112 interagit avec 3 MTases impliquées dans la modification de l’appareil de traduction (Mtq2 qui méthyle le facteur de terminaison eRF1, Trm11 et Trm9 qui méthylent des ARNt). En collaboration avec Denis Lafontaine (Université Libre de Bruxelles, Charleroi, Belgique), nous avons montré plus récemment une nouvelle fonction de la protéine Trm112 dans la biogenèse des ribosomes via son interaction avec Bud23, une MTase spécifique de la base G1575 de l’ARNr 18S. En l’absence de Trm112, Bud23 est instable in vivo et ne peut plus interagir avec les pré-ribosomes naissants. Ceux-ci sont alors rapidement dégradés par le mécanisme de surveillance nucléolaire impliquant le complexe TRAMP (Figaro et al., 2012).

bla bla
Profil de polysome chez S. cerevisiae Les interactions de Trm112

  Trm112 est un activateur de MTase ayant pour substrats des molécules aussi différentes que des ARN et une protéine essentielle à la terminaison de la traduction. Trm112 se trouve donc à une position stratégique à l’interface entre la biogenèse du ribosome et sa fonction dans la traduction.

  Actuellement, nous cherchons à comprendre au niveau moléculaire le rôle de la méthylation dans la traduction, la biologie de la cellule en général, et le lien avec diverses pathologies.

Collaborations

  • Marc Graille, CNRS UMR7654, Ecole Polytechnique, Palaiseau
  • Denis Lafontaine, FRS, Université Libre de Bruxelles, Charleroi-Gosselies, Belgique
  • Måns Ehrenberg, Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, Suède

Publications

2011

2008

2007

2006

2005

2003

2002

2000


.

AccueilImprimerContactPlan du siteCredits