Institut de Biologie Physico-Chimique

La sécrétion d'un neurotransmetteur par exocytose nécessite son accumulation dans les vésicules synaptiques par un mécanisme de transport actif faisant intervenir 2 protéines de la membrane vésiculaire: une ATPase pompe à protons, qui acidifie les vésicules, et un transporteur, qui échange les protons contre des molécules de neurotransmetteur (Figure 1). Sept transporteurs vésiculaires de neurotransmetteur, transportant les catécholamines, la sérotonine, l'acétylcholine, le GABA, la glycine ou le glutamate, sont connus à ce jour.

Nous avons identifié en 1997 le Transporteur Vésiculaire des Acides Aminés Inhibiteurs (VIAAT), c'est-à-dire du GABA et de la glycine, par une approche de clonage positionnel in silico (Figure 2 ; Sagné et coll. 1997) basée sur des travaux antérieurs de génétique du nématode Caenorhabditis elegans (McIntire et coll. 1993). Ce transporteur est aussi appelé "Transporteur vésiculaire du GABA" ou VGAT (McIntire et coll. 1997), bien qu'il soit également présent dans des terminaisons nerveuses glycinergiques (Chaudhry et coll. 1998 ; Dumoulin et coll. 1999).

L'équipe a aussi caractérisé l'activité d'isoformes du transporteur vésiculaire du glutamate (VGLUT2, VGLUT3) identifiées par Salah El Mestikawy, Bruno Giros et leurs collaborateurs (INSERM, Unité 513) (Herzog, Bellenchi et coll. 2001 ; Gras, Herzog et coll. 2002).

Nos recherches actuelles dans cette thématique portent sur le rôle de VIAAT dans la libération de glycine.

La plupart des transporteurs assurant l'évacuation des produits d'hydrolyse du lysosome vers le cytosol reste inconnue. En 2001, la caractérisation d'un paralogue de VIAAT nous a amené à identifier avec le groupe de B. Giros un premier transporteur lysosomal d'acide aminé, baptisé LYAAT-1 (Sagné et coll. 2001).

Ce transporteur était apparu initialement comme un transporteur plasmique du GABA exprimé dans divers types de neurones et activé en cis par un pH acide. Cependant, sa fonction physiologique restait obscure. L'activation par les protons suggérait un couplage ionique de type symport, c'est-à-dire un transport des H⁺ et du substrat dans la même direction (contrairement à  VIAAT qui échange ces 2 espèces). Cette propriété nous a conduit à envisager un rôle intracellulaire dans l’évacuation de métabolites des organites acides et, par voie de conséquence, à émettre l’hypothèse d’un rôle lysosomal de LYAAT-1 : l’activité de symport, entraînée par l’ATPase vacuolaire, permet un efflux actif des produits de l'hydrolyse lysosomale vers le cytosol. Cette proposition impliquait aussi que des acides aminés constitutifs des protéines, plutôt que le GABA, soient les substrats physiologiques de LYAAT-1. Ces hypothèses se sont révélées exactes: LYAAT-1 est majoritairement présent aux niveaux des lysosomes et il est capable de transporter la proline, l'alanine et la glycine à travers les membranes (Sagné et coll. 2001; voir Boll et coll. 2004 pour une revue des travaux postérieurs).

L’élucidation du rôle cellulaire de LYAAT-1 nous a fourni de manière fortuite une approche générale pour étudier les processus d'efflux lysosomal. En effet, l'activité de transport de LYAAT-1 avait pu être observée sur des cellules intactes grâce à la présence d'un faible taux de transporteur à la membrane plasmique. Cette présence à la surface cellulaire a l'avantage de remplacer l'efflux lysosomal, peu accessible, par un influx cellulaire classique: quand la cellule est incubée à pH acide, elle  peut être comparée à un « lysosome géant inversé » (Figure 3).

Cette approche a été rationalisée avec le laboratoire de C. Antignac (INSERM U423, Hôpital Necker) pour étudier la cystinosine, une protéine membranaire lysosomale déficiente dans une néphropathie héréditaire caractérisée par une accumulation de cystine dans les lysosomes (Town et coll. 1998). En exprimant un mutant d'un motif de ciblage de la cystinosine vers les lysosomes plutôt que la protéine sauvage (Figure 3), nous avons démontré et caractérisé l'activité de transport de cystine de la cystinosine (Kalatzis et coll. 2001). Plus récemment, ce modèle expérimental a été utilisé pour caractériser l'effet de mutations pathogènes sur l'activité (Kalatzis et coll. 2004).

Nos recherches actuelles portes sur d'autres transporteurs du lysosome tels que ceux de l'acide sialique (Ruivo et coll. 2008), de la cobalamine (Rutsch et coll. 2009), et d'autres eux aussi  impliqués dans des pathologies lysosomales.

Techniques

L'équipe utilise toutes les techniques classiques de biologie moléculaire et cellulaire: caractérisation et mutagenèse dirigée d'ADNc, culture et transfection de lignées cellulaires, analyse et purification de protéines, fractionnement cellulaire, microscopie optique, etc.

Les transports membranaires sont étudiés par mesure de flux de molécules radiomarquées. Un équipement pour la détection électrophysiologique des transports dans l'ovocyte de Xénope (Opus Express, Molecular device) est disponible depuis  2004.

Principales publications

Kalatzis, V., Nevo, N., Cherqui, S., Gasnier, B. and Antignac, C. (2004) Molecular pathogenesis of cystinosis: effect of CTNS mutations on the transport activity and subcellular localization of cystinosin. Hum Mol Genet, 13, 1361-1371. PubMed

Gasnier, B. (2004) The SLC32 transporter, a key protein for the synaptic release of inhibitory amino acids. Pflugers Arch, 447, 756-759. PubMed

Boll, M., Daniel, H. and Gasnier, B. (2004) The SLC36 family: proton-coupled transporters for the absorption of selected amino acids from extracellular and intracellular proteolysis. Pflugers Arch, 447, 776-779. PubMed

Gras, C., Herzog, E., Bellenchi, G.C., Bernard, V., Ravassard, P., Pohl, M., Gasnier, B., Giros, B. and El Mestikawy, S. (2002) A third vesicular glutamate transporter expressed by cholinergic and serotoninergic neurons. J Neurosci, 22, 5442-5451. PubMed

Kalatzis, V., Cherqui, S., Antignac, C. and Gasnier, B. (2001) Cystinosin, the protein defective in cystinosis, is a H+-driven lysosomal cystine transporter. EMBO J, 20, 5940-5949. PubMed

Sagné, C., Agulhon, C., Ravassard, P., Darmon, M., Hamon, M., El Mestikawy, S., Gasnier, B. and Giros, B. (2001) Identification and characterization of a lysosomal transporter for small neutral amino acids. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 7206-7211. PubMed

Herzog, E., Bellenchi, G.C., Gras, C., Bernard, V., Ravassard, P., Bedet, C., Gasnier, B., Giros, B. and El Mestikawy, S. (2001) The existence of a second vesicular glutamate transporter specifies subpopulations of glutamatergic neurons. J Neurosci, 21, RC181. PubMed

Bedet, C., Isambert, M.F., Henry, J.P. and Gasnier, B. (2000) Constitutive phosphorylation of the vesicular inhibitory amino acid transporter in rat central nervous system. J Neurochem, 75, 1654-1663. PubMed

Dumoulin, A., Rostaing, P., Bedet, C., Levi, S., Isambert, M.F., Henry, J.P., Triller, A. and Gasnier, B. (1999) Presence of the vesicular inhibitory amino acid transporter in GABAergic and glycinergic synaptic terminal boutons. J Cell Sci, 112, 811-823. PubMed

Sagné, C., El Mestikawy, S., Isambert, M.F., Hamon, M., Henry, J.P., Giros, B. and Gasnier, B. (1997) Cloning of a functional vesicular GABA and glycine transporter by screening of genome databases. FEBS Lett, 417, 177-183. PubMed

Dernière mise à jour : 30/07/2009